一、醋酸白試驗 用3-5%醋酸外涂疣體2-5分鐘,病灶部位變白稍隆起,肛門病損可能需要15分鐘。本試驗的原理是蛋白質(zhì)與酸凝固變白的結(jié)果,HPV感染細胞產(chǎn)生的角蛋白與正常的未感染上皮細胞產(chǎn)生的不同,只有前者才能被醋酸脫色。醋酸白試驗檢測HPV的敏感性很高,它比常規(guī)檢測觀察組織學(xué)變化還好。但偶爾在上皮增厚或外傷擦破病例中出現(xiàn)假陽性、假陽性變白跡象顯得界限不清和不規(guī)則。美國CDC提示,醋酸白試驗并不是特異試驗,且假陽性較常見。
二、免疫組織學(xué)檢查 常用過氧化物酶抗過氧化物酶方法(即PAP),顯示濕疣內(nèi)的病毒蛋白,以證明疣損害中有病毒抗原。HPV蛋白陽性時,尖銳濕疣的淺表上皮細胞內(nèi)可出現(xiàn)淡紅色的弱陽性反應(yīng)。
三、組織化學(xué)檢查 取少量病損組織制成涂片,用特異抗人類乳頭瘤病毒的抗體作染色。如病損中有病毒抗原,則抗原抗體結(jié)合。在過氧化物酶抗過氧化物酶(PAP)方法中,核可被染成紅色。此法特異性強且較迅速,對診斷有幫助。 四、病理檢查 主要為角化不全,棘層高度肥厚,乳頭瘤樣增生,表皮突增厚,延長,其增生程度可似假性上皮瘤樣。刺細胞和基底細胞并有相當數(shù)量的核分裂、頗似癌變。但細胞排列規(guī)則,且增生上皮和真皮之間界限清楚。其特點為粒層和刺層上部細胞有明顯的空泡形成。此種空泡細胞較正常大,胞漿著色淡、中央有大而圓,深嗜堿性的核。通常真皮水腫、毛細血管擴張以及周圍較致密的慢性炎性浸潤。Bushke-loewenstein巨大型尖銳濕疣,表皮極度向下生長,代替了其下面的組織、易與鱗狀細胞相混,故須多次活檢。若有緩慢發(fā)展之傾向, 則為一種低度惡變的過程,即所謂疣狀癌。
五、基因診斷 迄今,HPV難于用傳統(tǒng)的病毒培養(yǎng)及血清學(xué)技術(shù)檢測,主要實驗診斷技術(shù)是核酸雜交。近年來發(fā)展的PCR方法具有特異、敏感、簡便、快速等優(yōu)點,為HPV檢測開辟了新途徑。 。ㄒ唬吮镜牟杉疤幚 1.標本的采集和預(yù)處理:用刮板或生理鹽水浸潤的棉棒從陰道和宮頸外口取分泌物和細胞。在作細胞學(xué)檢查的同時,將標本放入5ml含有0.05%硫柳汞的PBS中,用PBS離心(3000g,10min)洗滌2次,沉積細胞重懸于1mlPBS中,取0.5ml細胞懸液抽提DNA。 2.標本核酸的提。喊1體積細胞懸液加10倍體積的細胞裂解液(10mmol/L Tris-HCl,pH 7.4,10mmol/L EDTA,150mmol/L NaCl,0.4%SDS,1.0mg/ml蛋白酶K)37℃下處理過夜;且等體積酚/氯仿(1:1),氯仿/異戊醇(24:1)各抽提2次;加1/10體積3mol/L NaAc(pH 5.2)及2.5倍體積無水乙醇置-20℃ 2h或過夜沉淀DNA;加1體積乙醇洗滌1次;用60μl含RNA酶(100μg/ml)的TE液(10mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,1.0mmol/L EDTA)溶解DNA,37℃溫育30min。 。ǘ㏄CR擴增 1. 引物設(shè)計和合成:HPV基因組可分為早期區(qū)(E)和晚期區(qū)(L),每區(qū)含一系列開放讀碼框架(ORF)。序列分析表明,各型HPV的非編碼區(qū)及E1、E6、E7和L1區(qū)均有保守序列。Manos等從HPVL1區(qū)中選擇保守序列設(shè)計合成引物MY11和MY09見表1,該引物與HPV 6、11、16、18及33型有互補序列,也可擴增其它型HPV。 Manos等設(shè)計的HPVL1通用引物 MY11:GCMCAGGGWCATAAYAATGG MY09:CGTCCMARRGGAWACTGATC 表1 HPV型 MY11的第1個鹼基位置 MY09的第1個鹼基位置 PCR產(chǎn)物長度(bp) 6 6722 7170 448 11 6707 7155 448 16 6584 7035 451 18 6558 7012 454 33 6539 6987 448 M=A+C, R=A+G,W=A+T,Y= C+T 表2列述了Manos等設(shè)計的寡核苷酸探針。公用混合探針序列選自HPVL1區(qū)中另一保守序列,可與MY11和MY09引物產(chǎn)生的多種HPVL1 PCR擴增產(chǎn)物雜交:型特異探針只與相應(yīng)HPV型有互補序列,用于檢出的HPV分型。 表2 Manos等設(shè)計的HPVL1 PCR產(chǎn)物探針 |